化(hua)學發(fa)(fa)光(guang)技(ji)術是近(jin)二、三十年來(lai)發(fa)(fa)展起來(lai)的(de)一種測(ce)定(ding)方(fang)式。該(gai)技(ji)術的(de)原理是利用化(hua)學反應釋(shi)放的(de)自由能(neng)激(ji)發(fa)(fa)中間(jian)體(常用堿(jian)性磷酸(suan)酶-金剛(gang)烷胺、辣根過氧化(hua)酶-魯(lu)米諾衍生物(wu)、辣根過氧化(hua)酶-魯(lu)米諾衍生物(wu)），使其從(cong)激(ji)發(fa)(fa)態(tai)(tai)回到(dao)基態(tai)(tai)。當(dang)中間(jian)體從(cong)激(ji)發(fa)(fa)態(tai)(tai)回到(dao)基態(tai)(tai)時會釋(shi)放等能(neng)級的(de)光(guang)子，對光(guang)子進(jin)行(xing)測(ce)定(ding)而進(jin)行(xing)定(ding)量分(fen)(fen)析(xi)。化(hua)學發(fa)(fa)光(guang)具有(you)熒光(guang)的(de)特異性，同時不(bu)需(xu)要激(ji)發(fa)(fa)光(guang)，避免了熒光(guang)分(fen)(fen)析(xi)中激(ji)發(fa)(fa)光(guang)雜散光(guang)的(de)影響從(cong)而提高了靈敏度，并且避免了放射分(fen)(fen)析(xi)造成的(de)環境污染和健康(kang)危害(hai)，是一種非常優秀的(de)定(ding)量分(fen)(fen)析(xi)方(fang)法。

化(hua)學發光免(mian)疫(yi)分析（CLIA）是一(yi)種高度敏感的(de)微量(liang)測定(ding)技術，凡具(ju)有抗(kang)原性的(de)物質（包括半(ban)抗(kang)原）都可以(yi)用CLIA測定(ding)。CLIA起步于80年代初(chu)，快(kuai)速發展于90年代具(ju)備以(yi)下特點(dian) ：

①高(gao)度敏(min)感，極限達(da)10-17－10-19mol/L，遠高(gao)于放(fang)射性免(mian)疫(yi)（RIA）、酶聯免(mian)疫(yi)（EIA）。與時間分辨熒光免(mian)疫(yi)分析(TRFIA)相(xiang)當(dang)，但(dan)比TRFIA便宜。

②特(te)異性強，重復性好(hao)CV＜10％。

③測定范圍寬，可達7個(ge)數量(liang)級。

④試劑(ji)穩定性(xing)好，無污(wu)染有(you)效期12月(yue)。

⑤操作簡(jian)單(dan)，易于自動化。

磁微粒化學發(fa)光(guang)免(mian)疫(yi)分(fen)析(xi)是將磁性(xing)分(fen)離技(ji)術、化學發(fa)光(guang)技(ji)術、免(mian)疫(yi)分(fen)析(xi)技(ji)術三(san)者結合起來(lai)的一種新興分(fen)析(xi)方法，其基本原理見(jian)圖(tu)3 。該技(ji)術充(chong)分(fen)利用(yong)了磁性(xing)分(fen)離技(ji)術的快速易自動化性(xing)，化學發(fa)光(guang)技(ji)術的高靈敏度性(xing)，以及免(mian)疫(yi)分(fen)析(xi)的特異性(xing)，在生物分(fen)析(xi)領域展現了不可替代的作用(yong)。

磁微粒化學發光免疫檢測（雙抗夾心法）

目前磁(ci)微粒化學分析(xi)(xi)免疫分析(xi)(xi)已(yi)經應用于管式化學發光(guang)免疫檢測(ce)項(xiang)(xiang)目以及電化學發光(guang)免疫檢測(ce)項(xiang)(xiang)目。

磁珠用于化學發光領域的方法

間接法

間(jian)(jian)接(jie)法就(jiu)是(shi)包被抗(kang)原，然后用酶標記的(de)(de)抗(kang)抗(kang)體(ti)檢測(ce)(ce)樣(yang)本中抗(kang)體(ti)，基本原理見圖(tu)4，適合于檢測(ce)(ce)對(dui)象是(shi)自(zi)身(shen)抗(kang)體(ti)的(de)(de)情況。間(jian)(jian)接(jie)法的(de)(de)優點(dian)：相(xiang)對(dui)較(jiao)方便，只要(yao)變換包被抗(kang)原就(jiu)可以檢測(ce)(ce)不同的(de)(de)項目。間(jian)(jian)接(jie)法的(de)(de)缺點(dian)：標本中的(de)(de)特異性抗(kang)體(ti)會競爭性的(de)(de)結(jie)(jie)合抗(kang)原，使結(jie)(jie)果出現假陰(yin)性。

圖4. 采用間接法進行化學發光檢測基本原理

操作步驟：

a)磁性微球表面固(gu)定抗原。

b)加入樣本（含目標抗體）孵育(yu)，清洗。

c)加入酶標抗(kang)抗(kang)體(ti)孵育，清洗。

d)加發光(guang)底(di)物，檢測信號。

捕獲法

血清中針(zhen)對某些抗原的(de)特異(yi)(yi)性(xing)IgM常(chang)和特異(yi)(yi)性(xing)IgG同時存(cun)在，后(hou)者(zhe)會(hui)干擾IgM抗體(ti)的(de)測(ce)定，因此測(ce)定IgM抗體(ti)多用捕獲(huo)法。基本原理如圖5所(suo)示，先(xian)將所(suo)有血清IgM（包(bao)括異(yi)(yi)性(xing)IgM和非特異(yi)(yi)性(xing)IgM）固(gu)定在固(gu)相上(shang)，去除IgG后(hou)測(ce)定特異(yi)(yi)性(xing)IgM。

 采用捕獲法進行化學發光檢測基本原理

操作步驟：

a)將抗人IgM抗體連(lian)接(jie)在固(gu)相(xiang)載體上形成固(gu)相(xiang)抗人IgM，洗滌(di)。

b)加入稀釋的(de)(de)血清標本中的(de)(de)IgM抗(kang)(kang)體被固(gu)相(xiang)抗(kang)(kang)體捕(bu)獲洗滌除(chu)去其他免疫球蛋白和血清中的(de)(de)雜質(zhi)成分。

c)加入(ru)特(te)異性抗原試(shi)劑：它只與固相上的特(te)異性IgM結(jie)合洗滌。

d)加入針(zhen)對特(te)異性的酶標抗(kang)體：使(shi)之與結合(he)在固(gu)相上(shang)的抗(kang)原反應結合(he)洗(xi)滌。

e)加底物顯(xian)色，檢(jian)測信號。

固相抗原競爭法

競(jing)爭(zheng)法(fa)，是指受(shou)檢(jian)抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)和(he)酶標抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)競(jing)爭(zheng)性的(de)與(yu)磁珠(zhu)表(biao)面抗(kang)(kang)(kang)原(yuan)結合(he)(he)。固相(xiang)抗(kang)(kang)(kang)原(yuan)競(jing)爭(zheng)法(fa)基本(ben)原(yuan)理如圖6所示。結合(he)(he)于固相(xiang)載體(ti)(ti)的(de)酶標抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)與(yu)受(shou)檢(jian)抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)的(de)量呈(cheng)反比(bi)。若受(shou)檢(jian)樣(yang)本(ben)中無抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)，酶標抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)能夠順(shun)利與(yu)抗(kang)(kang)(kang)原(yuan)結合(he)(he)，出現強(qiang)信(xin)號。若受(shou)檢(jian)樣(yang)本(ben)中有抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)，則競(jing)爭(zheng)性的(de)占去了酶標抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)與(yu)抗(kang)(kang)(kang)原(yuan)的(de)結合(he)(he)，酶標抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)的(de)結合(he)(he)力減弱，信(xin)號強(qiang)度(du)減弱。

.采用固相抗原競爭法進行化學發光檢測基本原理

操作步驟：

a)磁珠(zhu)表(biao)面固(gu)定特(te)異性(xing)抗原。

b)加受檢標本和酶標抗原的混合液孵育。

c)加發光(guang)底物，檢測信號。

雙抗夾心（兩步法）

雙抗體夾心法是檢測抗原(yuan)(yuan)最常用的(de)方法，基本原(yuan)(yuan)理如圖7所示(shi)。

 采用雙抗夾心法（兩步法）進行化學發光檢測基本原理

操作步驟：

a)將特異(yi)性抗(kang)體與固相(xiang)(xiang)載體連接，形成固相(xiang)(xiang)抗(kang)體：洗滌除去未結(jie)合的抗(kang)體及雜。

b)加受(shou)檢標本(ben)：使之與固(gu)(gu)相抗(kang)體(ti)接觸(chu)反(fan)應一(yi)段(duan)時問，讓(rang)標本(ben)中(zhong)的(de)抗(kang)原與固(gu)(gu)相載體(ti)上的(de)抗(kang)體(ti)結(jie)合(he)，形成固(gu)(gu)相抗(kang)原復合(he)物。洗(xi)滌除去(qu)其他(ta)未結(jie)合(he)的(de)物質(zhi)。

c)加酶標抗(kang)(kang)(kang)體：使固(gu)(gu)相(xiang)免(mian)疫復(fu)合(he)物(wu)上(shang)的(de)抗(kang)(kang)(kang)原與酶標抗(kang)(kang)(kang)體結合(he)。徹底洗滌(di)未結合(he)的(de)酶標抗(kang)(kang)(kang)體。此時(shi)固(gu)(gu)相(xiang)載體上(shang)帶有的(de)酶量與標本中(zhong)受檢物(wu)質的(de)量成正相(xiang)關。

d)加(jia)發光底物(wu)(wu)：夾心(xin)式復合物(wu)(wu)中的(de)酶催化(hua)底物(wu)(wu)成為(wei)有色產(chan)物(wu)(wu)。根據顏色反應的(de)程度進行該抗原的(de)定性或定量。

雙抗夾心法（一步法）

在一(yi)步法測定中(zhong)，應(ying)注意(yi)鉤(gou)狀效(xiao)應(ying)（hook effect），類同于沉淀反應(ying)中(zhong)抗原過(guo)剩的后帶(dai)現(xian)象(xiang)。當(dang)標本中(zhong)待(dai)測抗原濃(nong)度相當(dang)高時，過(guo)量抗原分別和固相抗體及(ji)酶標抗體結合(he)，而不再形成夾心(xin)復合(he)物，所得(de)結果將低于實際含(han)量。鉤(gou)狀效(xiao)應(ying)嚴(yan)重(zhong)時甚至可出現(xian)假(jia)陰性結果（如圖8， 雙(shuang)抗夾心(xin)法及(ji)雙(shuang)位點(dian)一(yi)步法。缺點(dian)：假(jia)陰性）

采用雙抗夾心法（一步法）進行化學發光檢測基本原理

采用雙抗夾心法（一步法）進行化學發光檢測，當樣本中抗原量較多是，容易出現假陰性。

操作步驟：

a)磁珠表面固定一(yi)抗(kang)。

b)加樣本(ben)和酶標二(er)抗孵育，清洗。

c)加發(fa)光底物，檢測信號。